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    公开号:WO1992003736A1
    申请号:PCT/JP1991/001118
    申请日:1991-08-22
    公开日:1992-03-05
    发明作者:Shigenori Tanaka；Hiroshi Tamura
    申请人:Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 ェ ン ド トキシ ンの測定剤
    [0002] 技 術 分 野
    [0003] 本発明は、 力ブ トガニ ' ァメ ボサイ ト · ライセー 卜を用いる ェ ン ド トキシ ンの測定剤に関する。 背 景 技 術
    [0004] カブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセー ト （以下、 単にライセ 一 卜 という） を使用 して、 エン ド トキシ ンを測定する方法が知 られている。 この方法は、 ライセー トが微量のエン ド トキシ ン によ り凝固することに基づいているが、 その後の生化学的解明 によ り、 該凝固反応はいく つかの凝固因子の段階的活性化によ りおこる こ とが明らかにされている （中村隆範ほか、 日本細菌 学雑誌、 38、 781-803 (1983 ) )0
    [0005] すなわち、 第 1 図に示すよう に、 ライセー トにエン ド トキシ ンが加わると C因子 （エン ド トキシン感受性因子、 分子量
    [0006] 123 , 000 )を活性化して活性型 C因子となり、 これは B因子 （分 子量 64 , 000 ) を限定水解し、 活性化して活性型 B因子となり、 これはプロ ク ロ ッティ ングェンザィム （分子量 54 , 000 ) を活性 化 してク ロ ッティ ングェ ンザィ ムに変換する。 ク ロ ッティ ン グ ェンザィムはコアギュ口一ゲン （凝固タ ンパク、 分子量 19,723 ) の A r g 18- T h r 19と A r g 46- G 1 y 47の特定箇所を限定 水解する ことによりペプチ ド Cを遊離し、 コアギュ口一ゲンを コアギュ リ ンに変換して凝固 （ゲル化） させる。 岩永らの方法 (Haemostasis, 7 ,183— 188 (1978) ) によ り 、 さ らに このコアギ ュ ロ一ゲンの水解部位と共通のア ミ ノ酸配列を持った合成ぺプ チ ド、 すなわち発色合成基質 B o c - L e u— G l y - A r g 一！）—ニ ト ロァニリ ド （ p NA) あるいは発蛍光合成基質 B o c— L e u— G 1 y - A r g— 4—メ チルクマ リ ノレ一 7—ア ミ ドとライセ一 トを組み合わせた定量性のある測定法が知られて いる。
    [0007] 該測定法は、 エ ン ド トキシ ンが引金 （ ト リ ガー） となって複 数の凝固因子 （全てセ リ ンプロテアーゼ前駆体） を順次活性化 するカスケ一 ド機構によって、 最終的にコアギユ リ ンゲルを形 成するという一連の反応を利用 している。
    [0008] また、 ライセー ト （ 1 → 3 ) — S— D—グルカ ンが加わる と、 第 1 図における G因子を活性化して活性型 G因子となり、 これ がプロ ク ロ ッ ティ ングェ ンザィ ムをク ロ ッ ティ ングェンザィ ム に変換し、 エン ド トキシンの場合と同様にク ロ ッティ ングェン ザィムがコアギュローゲンをコアギュ リ ンに変換してゲルを形 成し、 また合成基質を水解する （森田ら、 FEBS Lett. , 129, 318-321(1981) )0
    [0009] この G因子に反応する物質と しては （ 1 → 3 ) — β - Ό ー グ、 ルカ ン、 ク レスチ ン、 レ ンチナ ンなど、 さ らにはセルロース系 血液透析膜の洗浄液中及び該膜と接触した血液中に含まれる物 質などが知られており、 これらはいずれもゥサギ発熱試験によ り発熱性を示さないこ と も認められている。
    [0010] と ころで、 ェ ン ド トキシ ンはグラム陰性菌細胞壁の構成成分 と しても知られ、 特に血液中のェン ド トキシンを測定する こ と によ り体内におけるグラム陰性菌の存在を検知する こ とができ るので、 エン ド ト キ シ ンを （ 1 → 3 ) — S — D — グルカ ンの影 響を全く 受けずに、 高い感度で再現性良く 測定し得る方法が特 に臨床検査医学の分野で望まれている。
    [0011] ライセー ト中の C因子系を用いる こ とによりェン ド トキシ ン を測定する方法が報告されている （大林ら、 Clin. Chim. Acta. 149, 55-65 (1985) ) が、 この方法はライセ一 トをゲル濾過法 によ りあるいはへパリ ンまたはデキス ト ラ ン硫酸を固定化した ァフィ 二ティ ー担体を用いる ク ロマ ト グラフィ ーにより分画し、 ( 1 → 3 ) 一 /3 — D —グルカ ン感受性の G因子を除去する こ と により、 C因子、 B因子とプロク ロ ッティ ングェンザィムのみ で再構成する もので、 きわめて煩雑な操作を必要とする方法で ある。 発 明 の 開 示
    [0012] 本発明は、 （ 1 → 3 ) — /S — D —グルカ ン感受性因子に対す る抗体を使用 し、 （ 1 — 3 ) — S — D —グルカ ン感受性の G因 子の影響を受けずに、 ライセー ト中の C、 B因子による反応を 利用 してエ ン ド トキシ ンを測定する試薬に関する。
    [0013] すなわち、 本発明のエン ド トキシ ンの測定剤は、
    [0014] (1) ライセー ト と、 （ 1 → 3 ) — ^3 — D —グルカ ン感受性因 子に対する抗体とからなるェ ン ド トキシ ンの測定剤、 および
    [0015] (2) ( 1 → 3 ) 一 3 — D —グルカ ン感受性因子に対する抗体 を固定化した担体に、 ライセー トを接触させて得た （ 1 → 3 ) 一 β — D —グルカ ン感受性因子を実質的に含まないライセ一 ト からなるエン ド トキシ ンの測定剤、 である。
    [0016] ( 1 → 3 ) 一 9 一 D —グルカ ン感受性因子は、 前述したよう に （ 1 → 3 ) — ；3 — D —グルカ ンによって活性化される G因子 であり、 ライセー トを用いてエン ド トキシンを （ 1 → 3 ) — β 一 D —グルカ ンの影響を受ける ことなく 特異的に測定するには、 ライ セー ト に含まれる G因子の影響を排除しなければな らな い。 このため本発明では G因子に対する抗体をライセ一ト と共 に用いるか、 または抗 G因子抗体固定化による G因子を実質的 に含まないライセー トを用いる ものである。
    [0017] 本発明で使用するラ イセ一ト は、 リ ムルス · ポ リ フ ヱムス ( L . polyphemus 、 ア メ リ カ産 ） 、 タ キプレウ ス ' ギガス ( · gigas 、 タイ国、 マ レーシア半島産） 、 タキプレウス ' ト リ デンタツス （T . tridentatus^ 日本、 中国産） 、 カノレシノ スコ ノレピウス · ロッンディ 力ウダ （C . rotundi cauda 、 タイ国、 マ レーシァ半島産） 等のカブ トガ二から血リ ンパ液を採取し、 次 いで該血球を破碎し、 その成分 （ライセ一 ト ） を分離する。 ラ イセー トは— 4 0 °C以下に小分けして保存し、 必要に応じ凍結 融解して使用するのが望ま しい。
    [0018] 得られたライセ一 卜から G因子に対する抗体を製造するには、 まず抗原となる G因子を精製しなければならないが、 この方法 と しては、 ァガロース、 セフ ァ ロース （フ ア ルマシア社販売、 商品名） 、 またはその架橋体等の適当な担体にデキス ト ラ ン硫 酸、 へパ リ ン等を固定化したものにライセー トを接触させ、 G 因子を含む画分を採取する方法を採用することができる。 接触 させる方法と しては、 例えば、 上記固定化物とライセー ト とを 溶液中で接触させる方法、 カラムク ロマ ト グラフィ 一によ り接 触させる方法等を挙げる こ とができる。
    [0019] ( 1 → 3 ) 一 ^ 一 D —グルカ ン感受性因子を抗原とする抗体 は、 精製した （ 1 → 3 ) — — D —グルカ ン感受性の G因子ま たは C、 B因子を含まない G因子画分を抗原と して使用 し、 こ れら抗原に対するポ リ ク ローナル抗体およびモノ ク ロ一ナル抗 体を製造する。
    [0020] 本発明で使用するポ リ ク ローナル抗体の製造方法と しては、 該抗原をゥサギ、 ャギ等の被免疫動物に投与し、 得られた抗体 を、 さ らに精製するこ とが望ま しい。 被免疫動物に投与する際 に、 捕助剤 （アジュバン ド） を併用する こ とは抗体産生細胞を 賦活するので望ま しい。
    [0021] 本発明で使用するモノ ク ローナル抗体の製造方法と しては、 該抗原をマウ スまたはラ ッ 卜の腹腔内に投与した後に脾臓など を摘出 し、 該脾臓などから採取した細胞と腫瘍細胞株である ミ エローマ細胞とを細胞融合させて、 ハイ プリ ドーマを樹立し、 得られたハイ プリ ドーマを試験管内にて連続増殖させ、 さ らに 得られたハイプリ ドーマから上記抗原に対する特異抗体を連続 的に産生する細胞株を選別し、 この選別株を試験管内培養また はマ ウ スの腹腔などの生体内にて培養する こ とによつて、 モノ ク ロ一ナル抗体を大量に製造する方法を挙げるこ とができ る。 細胞融合に用いる細胞と しては、 脾細胞以外に リ ンパ節細胞お よび末梢血中の リ ンパ細胞等を用いる こ とができる。 また、 ミ エローマ細胞株は、 異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由 来のものが望ま し く 、 安定な抗体産生ハイプリ ドーマを得る こ とができる。
    [0022] 得られたポ リ ク ローナル抗体およびモノ ク ローナル抗体の精 製法と しては、 硫酸ナ ト リ ウム、 硫酸ア ンモニゥム等の中性塩 による塩析、 低温アルコール沈澱およびポ リ エチ レングリ コー ルまたは等電点による選択的沈澱分別法、 ないしは電気泳動、 D E A E —、 C M —誘導体等のイオン交換体やプロテイ ン Aな らびにハイ ドロキシァパタイ ト ®着体による吸脱着法、 ゲル濾 過および超遠心法等を挙げる ことができる。
    [0023] ェ ン ド トキシ ンを測定する上記（1)の方法において、 該抗体を ライセー ト とェン ド トキシ ン溶液中に存在させるには、 例えば ライセー トの凍結乾燥品を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解 して調製した溶液に、 該抗体溶液を添加する方法、 ライセー ト 中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を 蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、 ライセー 卜 と合成基質の凍結乾燥品を適当な緩衝液等で溶解して調製し た溶液に、 該抗体溶液を添加する方法、 ライセー ト と合成基質 の混合液中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得 た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、 および必要量の該抗体溶液を試料に添加する方法等が挙げられ る。
    [0024] また、 上記 (2)の方法に用いる該抗体の固定化担体にライセー トを接触させて G因子を含まないライセー トを得る方法と して は、 該担体にライセー トを接触させた後に、 遠心分離、 濾過等 の手法により該担体を除去する方法、 あるいは該担体を充塡し たカラムにライセ一 トを添加してその素通り画分を集める方法 等が挙げられる。
    [0025] 該抗体の固定化担体と しては、 例えばセル口フ ァ イ ン （生化 学工業株式会社販売、 商品名） またはセフ ァ ロ ー ス等の適当な 担体の水酸基と、 抗体のア ミ ノ基とを通常の方法によ り共有結 合させた固定化担体を用いるこ とができる。 担体と しては、 こ の他にもセルロース、 ァガロース、 ポ リ アク リ ルア ミ ド、 デキ ス ト ラ ン、 多孔性シ リ カ ビーズ等を用いる こ とができる。
    [0026] さ らにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法と して、 担 体に活性基を導入したのち、 抗体を結合させる方法、 例えば担 体をエポキシ活性化後ホルミ ル化したのち、 抗体を結合させる 方法等を挙げる こ とができる。
    [0027] ライセ一 トを固定化担体に接触させる場合の PHと しては、 ラ イセ一ト中の C因子およびェン ド トキシンと C因子により開始 される経路に関与する凝固因子が不活化されない程度の PHであ れば良いが、 好ま し く は PH 6〜 9 の範囲が好ま しい。 また、 接 触させる場合の温度と しては、 該凝固因子が同様に不活化され ない温度であれば良いが、 通常 0〜 4 5 °C、 より好ま し く は 0 〜 1 0 °Cである。
    [0028] 本発明によ り、 エン ド トキシ ンを測定する生体試料と しては、 血液、 血漿または血清の他に、 脳脊髄液、 腹水、 関節液、 胸水、 乳汁および尿などの体内外の浸出または排泄液を挙げる こ とが でき る。 たとえば、 血漿を試料とすると きは、 へパリ ン、 E D T A、 クェン酸等の抗凝固剤を加えて分離するこ とが必要であ る o 本発明の測定剤を用いてェン ド トキシ ンを測定するには、 合 成基質、 例えば、 前述の発色合成基質あるいは発蛍光合成基質 を反応液中に共存させ、 ク ロ ッティ ングェンザィ ムのア ミ ダー ゼ活性を測定する各種の方法、 凝固反応によるゲル形成の有無 を肉眼的に調べるゲル化法、 凝固に伴って生ずる濁度を適当な 光学系を用いて測定する比濁法、 一定の濁度に達するまでの時 間を適当な光学系を用いて測定する比濁時間分析法、 凝固に伴 つて生ずる粘性の変化を共振周波数の変化と してと らえ、 水晶 振動子ゲル化測定装置を用いて測定する方法等を採用するこ と ができ る。
    [0029] 本発明のェン ド トキシンの測定剤は、 G因子に対する抗体を 使用 しているので、 少量でも優れた G因子に対する特異的結合 能および中和効果を示すことが第一の特徴である。 また、 該抗 体はリ ムルス反応阻害物質と して知られているアンチ ト リ プシ ン、 ア ンチ ト ロ ン ビン IE等のセ リ ンプロテア一ゼィ ン ヒ ビタ ー 類を含まず、 C因子活性を損なわないことが第二の特徴である。 図面の簡単な説明
    [0030] 第 1 図はカブ トガニ血液凝固系のカスケ一ド機構を示す。 第 2 図は A剤、 D剤の （ 1 → 3 ) — ^ 一 D —グルカ ンに対す る反応性を示す。 第 3図は A、 D剤の E . coli 0111 ： B 4 ェ ン ド トキシ ンに対する反応性を示す。 第 4図は Salmonella enteritidis エン ド トキシ ンの水及び （ 1 → 3 ) — /3 — D - グルカ ン添加希釈液に対する D剤の反応性を示す。
    [0031] 第 5 図は実施例 8〜 1 0 の E . coli 0111 ： B 4 エ ン ド トキ シ ンの検量線を示す。
    [0032] 第 6 図は実施例 8 の血漿検体中のェ ン ド トキシ ン測定結果を 示す。
    [0033] 発明を実施するための最良の形態
    [0034] 以下に実施例を挙げ、 本発明をさ らに具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定される ものではない。
    [0035] 実施例 1
    [0036] G因子に対するポ リ ク ローナル抗体の製造
    [0037] カブ トガニ血リ ンパ液 1. 0 ^ を 4 °C下に、 1 , 500rpmで 1 0分 間遠心し、 その沈澱部分 （ァメ ーボサイ ト） 約 5 0 gに 250 rd の 0. 0 2 M ト リ ス—塩酸緩衝液 （PH8. 0 ) を加え、 ホモゲナイ ザ一 （ポ リ ト ロ ン R P T 1 0 (商標） 、 Kinematica社製） に て均一に破砕及び抽出し、 冷却遠心分離機 （ ト ミ 一精ェ R D — 2 0 IE ) にて、 10 , OOOrpm で 3 0分間遠心した。 得られた沈澱 物をさ らに 1 5 O r ^の同上緩衝液にて 2 回抽出し、 最終的に 5 5 のラ イ セ一トを得た。
    [0038] 同ライセ一ト全量を、 デキス トラ ン硫酸固定化セフ ァ ロース C L — 6 Bカラム （ 5 X 2 3 cm、 0. 0 5 M NaC_g含有 0. 0 2 M ト リ スー塩酸緩衝液 （ PH8. 0 ) で平衡化） に添加し、 0. 2 M
    [0039] NaC 含有 0. 0 2 M ト リ ス ー塩酸緩衝液 （ PH8. 0 ) にて溶出さ れる画分、 すなわち第 1 図に示す G因子を含む G因子画分を、 後記する大林らの方法 ( Clin, Chim, Acta. 149, 55 - 65(1985 ) ) により、 その活性を測定した。 ついでその 5 0 を 1 0 に減 圧濃縮後、 G因子の活性化を防ぐために 0. 2 3 gの E D T A — 4 Haを添加した。 その 1. Ο τπ に等量のフ ロ イ ン ト コ ンプリ ー ト ア ジ ュノ <ン ド (ャ ト ロ ン社販売、 商品名） を加え、 ゥサギ （ J W、 2. 5 kg) の背中、 尻および横腹のそれぞれに 0. 3 、 0. 3 および 0. 4 ずつ皮下注射 （感作） した。 感作は 2週間に 1 度計 5 回行い、 ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確認後、 最終感作日よ り 1 週間後に頸静脈を切開して全採血した。 ひきつづき室温 1 時間、 4 °C一晩放置後、 2,000rPmで 5分間遠心分離を行い、 得 られた血清 5 2 を 5 6 °Cで 3 0分間の熱処理を行い非働化し た。 その血清の 5 0 m£に対して 3 4 % (W/V)Ua2SO«溶液を 5 0 加え、 生じた沈澱を 10 , OOOrpm で 3 0分間遠心分離し、 得た 沈澱を 1 7 % ( W/V)Na2 SO 溶液で 2回洗浄し、 その沈澱を 0. 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （ PH8. 0 ) 5 0 に溶解した。 この溶液 に、 固形の Na2 SO* 7. 5 gを撹拌しながら溶かし込み、 生じた沈 澱を上記と同様の ト リ スー塩酸緩衝液に溶かし、 さ らに Na2 SO« 濃度 7. 5 g Z 5 0 τ ^の条件で沈澱操作を 3回繰り返し、 最終沈 澱を上記緩衝液に溶解した。 ひきつづき 0. 0 5 Μ ΝΗ, HC03で平 衡化したセルロ フ アイ ン GH-20m (生化学工業株式会社販売、 商 品名） カラム （ 2· 8 Χ 9 0 αη、 0. 0 5 M NH« HC03で溶出） を通 過させ脱塩した後、 凍結乾燥し、 ゥサギ抗 （G因子画分） 血清 の I g G画分を得た。
    [0040] 〔 G因子活性測定法〕
    [0041] 0. 2 M ト リ ス —塩酸緩衝液 （PH8. 0 、 0.013 M MgC£ 2 含有） 0. 1 m£に、 （ i → 3 ) — S — D — グルカ ン （カー ドラ ン ； 和光 純薬工業販売、 商品名 ； 4 0 0 ng/ jd) 0. 0 3 id, 各画分 0. 05 wi、 0.005 M N— タ ー シ ャ リ ー ブ トキシカルボニル （ B θ C ) - L e u - G l y - A r g - p N A ( p —ニ ト ロァニ リ ド） 0. 0 と凝固酵素前駆体 （プロク ロ ッティ ングェンザィム） 0. 0 を加え、 3 7 °Cで反応させる。 発色が認められる こ と を確認し、 0. 6 Mの酢酸 0. 8 を添加する こ とによ り反応を停 止し、 次いで 4 0 5 nmの吸光度を測定する。
    [0042] 実施例 2
    [0043] 精製 G因子に対するポ リ ク ローナル抗体の製造
    [0044] カブ トガニ血リ ンパ 1. 2 ^ を 4 °C下に 1, 500rpmで 1 0分間遠 心し、 その沈澱部分 （ァメ ーボサイ ト） 約 5 3 gに 2 5 Q rdの 0. 0 2 M ト リ スー塩酸緩衝液 （ PH8. 0、 0.001 Mベ ンズア ミ ジ ン、 0.001 M E D T A— 4 Na含有） を加え、 実施例 1 と同様 に破砕、 抽出後、 10 , OOOrpm で 3 0分間遠心した。 得られた沈 澱を 2 0 の同上緩衝液にてさ らに 2 回抽出 し、 最終的に 6 4 のライセ一トを得た。
    [0045] 同ライセー ト全量を、 デキス ト ラ ン硫酸固定化セフ ァ ロース
    [0046] CL-6B カ ラ ム （ 5 X 2 3. 5 cm、 0. 0 2 M ト リ スー塩酸緩衝液、 PH8. 0で平衡化） に添加し、 0. 2 M NaC_g含有 0. 0 2 M ト リ ス —塩酸緩衝液 （PH8. 0 ) にて溶出される G因子画分をカラムラ イ ト （生化学工業販売、 商品名） カラム （ 3. 0 X 2 9. 6 cm、 0. 0 2 M ト リ スー塩酸緩衝液、 PH8. 0で平衡化） に添加し、
    [0047] 0. 0 2 M ト リ スー塩酸緩衝液、 PH8. 0 および 0. 5 M炭酸水素ァ ンモニゥム各 8 0 で洗浄後、 2 M炭酸水素ア ンモニゥムに て溶出 し、 精製 G因子を得た。
    [0048] 上記により精製した G因子溶液 5 0 を 1 0 に濃縮後、 G 因子の活性化を防ぐため 0. 2 3 gの E D T A— 4 Naを添加した。 その 1. 0 m£に等量の フ ロ イ ン ト コ ンプ リ ー ト ア ジ ュノく ン ト を 加え、 ゥサギ （ J W、 2. 5 kg) の背中、 尻および横腹のそ れぞれに 0. 3 、 0. 3 m および 0. 4 づっ皮下注射 （感作） し た。 感作は 2週間に 1度計 5 回行い、 ゲル内二重拡散法により 抗体価の上昇を確認後、 最終感作日より 1週間後に頸静脈切開 により全採血した。 ひきつづき室温 1 時間、 4で一晚放置後、 2,000 rpm で 5分間遠心分離を行い、 得られた血清 6 5 を 5 6 °Cで 3 0分間の熱処理を行い非働化した。 その 5 0 の血清 に対して 3 4 % ( W/V)Ha2 S04溶液を 5 0 加え、 生じた沈澱を 10,000rpm で 3 0分間遠心分離し、 沈澱を 1 7 % (W/V)Na2 SO, 溶液で 2回洗浄し、 その沈澱を 0. 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH 8. 0 ) 5 0 τπΠこ溶解した。 この溶液に固形の Na2 SO< 7. 5 gを撹 拌しながら溶かし込み、 生じた沈澱を上記と同様の ト リ ス一塩 酸緩衝液に溶かし、 さ らに Na2 SO<濃度 7. 5 g Z 5 0 の条件で 沈澱操作を 3回繰り返し、 最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。 ひきつづき 0. 0 5 Μの NH« HC03 で平衡したセノレロ フ ア イ ン GH- 20m力ラム （ 2. 8 X 9 0 cm、 0. 0 5 M NH4 HC03にて溶出） を通 過させ脱塩した後、 凍結乾燥し、 抗 G因子血清の I g G画分を 得た。
    [0049] 実施例 3
    [0050] 精製 G因子に対するモノ ク ローナル抗体の製造
    [0051] 実施例 2で得られた G因子 0. (タ ンパク量、 2 0 0 g id) を等量のフロイ ン ト コ ンプリ 一 トアジュバン 卜 と混合し、 マウ ス （ B A L B C、 5週令、 体重 2 5 g ) の背中に 0.
    [0052] および尻に 0. を皮下注射し、 2度目の感作を 2週目に行 い、 3週後に S O O ^ g Z の G因子 0. 3 m£を静脈内投与し最 終免疫と した。 これより 4 日後に 9. 2 X 1 0 7 個の脾細胞を分 離し、 マ ウ ス ミ エローマ S P / 0細胞の 1. 8 X 1 0 7 個と常法 によ り融合させて、 ハイ プリ ドーマを作製した。 得られたハイ プリ ドーマにつき、 G因子に結合する こ と、 または G因子活性 を中和させるこ とができ るこ とを確認した。 つづいて、 上記と 同様のマウス腹腔内にプリ スタ ン （2,6,10,14 —テ トラ メ チル ペンタデカ ン） を 0. 投与し、 1 週後にハイ プリ ドーマ 3 X 1 0 7 個 匹を腹腔内に投与し、 腹水の大量貯留がみられる 2 週目に腹水を回収し、 4 0 %飽和硫酸ア ンモニゥムで I g G画 分を沈澱させ、 最終的な腹水型モノ ク ローナル抗体を得た。 実施例 4
    [0053] 抗 G因子抗体固定化セルロ フ アイ ンによる G因子不含ライセ 一ト の調製
    [0054] 実施例 1 に記載の方法で得られたライセー ト 1 を、
    [0055] 0. 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （ PH8. 0、 0. 1 5 M Nac^含有） で 平衡化したェン ド トキシンおよび ^ ーグルカ ン不含の抗 G因子 抗体固定化セル口 フ ァ イ ン （調製方法は後記） カ ラ ム （ 1. 2 X 1 1 cm) に添加し、 0. 1 M ト リ ス—塩酸緩衝液 （ PH8. 0 、 1 M NaC 含有） にて洗浄後、 素通り した非吸着画分を集め、 G因 子を実質的に含まない G因子不含ライセ一トを得た。
    [0056] 〔抗 G因子抗体固定化セルロ フ アイ ンの調製方法〕
    [0057] ホルミ ルセル口フ ァ イ ン 1 0 gを 0. 1 Mリ ン酸— Na緩衝液 (PH7. 1 ) で充分洗浄し、 実施例 1〜 3 に記載の G因子に対す る抗体溶液 （ 1 0 mg 0. 1 Mリ ン酸一 Na緩衝液、 pH7. 1 ) 2 0 m£に懸濁し、 HaCNBH3 5 O m を加え溶解させる。 ひきつづ き室温で 8 時間ゆるやかに撹拌し、 0. 2 M ト リ スー塩酸緩衝液 ( PH7. 0 ) で洗浄、 濾過し、 1 0 mgの NaCNBH3 を含む 5 m の上 記緩衝液を加え、 室温で 3時間振と うする。 その後、 0. 1 M ト リ ス一塩酸緩衝液 （ PH8. 0、 0. 1 5 M NaC^含有） で充分洗浄 する。
    [0058] 実施例 5
    [0059] ェン ド トキシ ンの測定
    [0060] 以下の方法で 3種類の試薬を調製し、 3種類の試料について その反応性を比較検討した。
    [0061] A剤は、 ライセ一 ト 4 4 0 〃 ^、 塩化マグネシウム 4 4 0 モル、 および B o c — L e u— G l y - A r g - p N A 2. 8 6 モルを混合し、 凍結乾燥して調製した。 B剤は、 A剤の成分 に実施例 1 で調製した抗 G因子画分血清の I g G画分の 1 O mg 0. 0 2 M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH8. 0 ) 1 8 0 を添加、 混合し、 凍結乾燥して調製した。 C剤は A剤の成分に実施例 2 で調製した抗 G因子血清の I g G画分の 1 O mg/ O. 0 2 M b リ ス一塩酸緩衝液 1 8 0 を添加、 混合し、 凍結乾燥して調 製した。
    [0062] 3種類の試薬それぞれを 2. 2 ^の 0. 2 M ト リ スー塩酸緩衝液
    [0063] (PH8. 0 ) に溶解させ、 その溶液 0. l m を試験管に分注し、 そ こへ試料 0. を添加してよ く 混合し、 3 7 °Cにて 3 0分間反 応させた。 3種類の試薬に対する試料の反応性は、 3 0分後に 生じた p N Aを、 0. の 0. 0 4 %亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0. 4 8 M塩酸溶液） 、 0. 3 %スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0. 0 7 % - ( 1 一ナフチル） エチ レンジァ ミ ン二塩酸塩を順次添加し て発色させ、 5 4 5 nmの吸光度値で示した。 その結果を第 1 表 に示した。 この結果から、 G因子画分に対するポ リ ク ロ—ナル 抗体及び G因子に対するポ リ ク ローナル抗体を添加して調製し た試薬を用いれば、 （ 1 → 3 ) — 3— D—グルカ ンの影響を受 けずに、 ェン ド トキシンを特異的に定量する こ とができる こ と は明らかである。
    [0064] (以下余白）
    [0065] 第 1 表 ά^ι 料 反応性 （ Δ A545nm/30min)
    [0066] (pg/tube) A剤 B剤 C剤 エン ド トキシン * ゲルカ ン " 抗体なし G因子画分抗体 G因子抗体
    [0067] 3.0 0.242 0.001 0.001
    [0068] 2.5 0.447 0.445 0.448
    [0069] 2.5 3.0 0.691 0.447 0.446
    [0070] * … E. coli 0111 :B4 由来
    [0071] * *…力一 ドラ ン
    [0072] 実施例 6
    [0073] ェ ン ド トキシ ンの測定
    [0074] 以下の方法で 2 種類の試薬を調製 し、 エ ン ド ト キシ ン及び ( 1 → 3 ) 一 3 — D —グルカ ンに対する反応性を比較検討した。 A剤は、 ラ イセー ト 4 4 0 〃 、 塩化マグネ シウム 4 4 0 〃 モル、 8 0 <: — 1^ 6 11 — 1 7 — £ ー 2. 8 6 モル を混合し、 凍結乾燥して調製した。 D剤は A剤の成分に、 実施 例 3 で調製した精製 G因子に対して中和能のあるモノ ク ロ一ナ ル抗体を含む溶液 8 0 / / を添加し、 凍結乾燥して調製した。
    [0075] 2種類の試薬それぞれ 2. 2 τ ^の 0. 2 M ト リ ス ー塩酸緩衝液
    [0076] (ΡΗ8. 0 ) に溶解させ、 その溶液 0. 1 を試験管に分注し、 そ こへ試料 0. を添加してよ く 混合し、 3 7 °Cにて 3 0分間反 応させた。 2種類の試薬に対する試料の反応性は、 3 0分後に 生じた p N Aを 0. の 0. 0 4 %亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0. 4 8 M 塩酸溶液） 、 0. 3 %スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0. 0 7 % N - ( 1 一ナフチル） エチ レ ンジァ ミ ン二塩酸塩を順次添加して 発色させ、 5 4 5 nmの吸光度値で示した。
    [0077] 第 2 図は （ 1 → 3 ) — ^ — D —グルカ ンに対する反応性を比 較した実験結果である。 A剤は （ 1 → 3 ) 一 β — Ό — グルカ ン に対して濃度依存的に反応するが、 D剤は 1 , 000 ngZ ^の （ 1 → 3 ) — /3 — D —グルカ ンに対しても全く 反応しない。 この結 果は、 精製 G因子に対するモノ ク ローナル抗体が、 ライセー ト 中の G因子を完全に中和し、 （ 1 — 3 ) — 3 — D —グルカ ンに 対する反応性を消失させている こ とを示している。
    [0078] 第 3 図は、 A、 D両試薬のエ ン ド トキシ ンに対する反応性を 用量反応曲線で比較した結果である。 2つの試薬の用量反応曲 線はほとんど一致しており、 このことは D剤に含まれる精製 G 因子に対するモノ ク ローナル抗体が、 ライセー 卜のェン ド トキ シ ンに対する反応性に全く 影響を与えないこ とを示している。 第 4図はエン ド トキシ ンの蒸留水による希釈系列と、 1 0 0 ng/ idの ( 1 → 3 ) — ;3 — D—グルカ ン溶液による希釈系列に 対する D剤の用量反応曲線である。 2つの用量反応曲線はほと んど一致しており、 このことは、 D剤を用いれば、 試料中に混 在する （ 1 — 3 ) — ^ 一 D—グルカ ンには全く 影響されずにェ ン ド トキシ ンを特異的に定量できるこ とを示している。
    [0079] 以上の結果から、 精製 G因子に対するモノ ク ローナル抗体を 添加して調製した試薬を用いれば、 （ 1 → 3 ) — ー D—グル カ ンの影響を受けずに、 エン ド トキシ ンを特異的に定量する こ とができる こ とは明らかである。
    [0080] 実施例 7
    [0081] ェン ド トキシ ンの測定
    [0082] 以下の方法で 2種類の試薬を調製し、 3種類の試料について その反応性を比較検討した。
    [0083] A剤は、 ライセー ト 4 4 0 £、 塩化マグネシウム 4 4 0 モルおよび B o c — L e u — G l y — A r g— p N A 2. 8 6 ;tz モルを混合し、 凍結乾燥して調製した。 E剤は、 実施例 4 で調 製した G因子不含ライセー ト 4 4 0 ^、 塩化マグネシウム 4 4 0 モノレ、 B o c — L e u— G l y — A r g— ρ Ν Α 2· 86 モルを混合し、 凍結乾燥して調製した。
    [0084] 2種類の試薬それぞれを 2. の 0. 2 M ト リ ス—塩酸緩衝液 (PH8. 0 ) に溶解し、 その溶液 0. 1 を試験管に分注し、 そ こ へ試料 0. 1 を添加してよ く 混合し、 3 7 °Cにて 3 0分間反応 させた。 2種類の試薬に対する試料の反応性は、 3 0分後に生 じた p N Aを、 0. 5 の 0. 0 4 %亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0. 4 8 M 塩酸溶液） 、 0. 3 %スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0. 0 7 % N
    [0085] ― ( 1 —ナフチル） エチ レ ン ジァ ミ ン二塩酸塩を順次添加して 発色させ、 5 4 5 ηπιの吸光度値で示した。 その結果を第 2表に 示した。 この結果から、 G因子不含ライセ一 トを用いて調製し た試薬によれば、 ( 1 → 3 ) 一 /3 — D—グルカ ンの影響を全く 受けずに、 エン ド トキシンを特異的に定量する こ とができ る こ と は明らかである。
    [0086] (以下余白）
    [0087] 第 2表 試 料 反応性 ( Δ A545nm/30min)
    [0088] (pg/tube) A剤 E剤 エン ド トキシン * グルカ ン * * ライセー 卜 G因子不含ライセ一ト
    [0089] 3.0 0.227 0.001
    [0090] 2.5 0.439 0.437
    [0091] 2.5 3.0 0.668 0.439
    [0092] * - E. coli 0111 :B4 由来
    [0093] * *…力一 ドラ ン
    [0094] 実施例 8
    [0095] 血漿検体の測定
    [0096] 対象は、 グラム陰性菌による敗血症を疑った自治医大血液科 に入院中の白血病等の重症血液疾患および感染を合併した肝、 胆道疾患を有する患者の 2 5例で、 それぞれ無菌的に採血した へパリ ン加血液を試料と して、 4 °Cで 1 5 0 X G、 1 0分間遠 心して多血小板血漿 （ P R P ) を得た。 その 0. 1 に 0. 3 2 M の過塩素酸 0. 2 を加え、 3 7 °Cで 2 0分間加温し、 析出物を 遠心 （3 , 000 rpni、 1 0分間） 除去し、 その上清 0. 0 5 に 0. 18 M NaOH を 0. 0 5 加えて中和し被検液と した。
    [0097] ひきつづき実施例 6 に記載の方法で調製した、 本発明による エン ド トキシ ン測定剤 0. 1 7 ^を加え、 3 7 °Cで 3 0分間加温し た。 この溶液に 0. 0 4 %亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0. 4 8 M塩酸溶 液） 、 0. 3 %スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0. 0 7 % N— ( 1 一ナフチル） エチ レ ンジア ミ ンニ塩酸塩の各 0. を順次加え てジァゾカ ッ プリ ングし、 5 4 5 nmでその吸光度を測定し、 別 に作成した検量線 （第 5 図） の a より Ε · col i 0111： B 4 ェ ン ド トキシ ン換算値と して表わ した。 第 6 図に示すよう に 2 5例 全例において高濃度のエン ド トキシンが検出され （健常人 2 5 例 ： 0. 8 ± 0. 6 pg/ wi ) 、 その う ちの 3例 （ *印） は血培にて、 イ シ エ リ キア ' コ リ （ Escherichia col i ) 、 シュ一 ドモナス ' エノレギノ 一サ ( Pseudomonas aeruginosa ) 、 ク レブシエラ · 二 ュ一モニエ （Klebsiel l a pneumoniae )をそれぞれ検出 し、 残り の 2 2例は血培では陰性であつたが、 発熱、 白血球数、 その他 臨床症状及び抗生物質感受性よ り グラム陰性菌敗血症と診断さ れた。 従って、 本発明方法は通常の検査法では診断がきわめて 困難なグラム陰性菌敗血症の迅速診断法と してきわめて有力な 手法と して評価されう る ものである ことが理解できょう。
    [0098] 実施例 9
    [0099] 尿検体の測定
    [0100] 自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、 尿培養で イ シ エ リ キア ' コ リ （ Escherichia col i ) 、 セラチア · マノレセ ッセ ンス ( Serratia marcescens )を検出した 3症例につき、 本 発明方法による尿中ェン ド トキシ ンの定量を行った。
    [0101] 尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コ ッ プに採取し、 その 0 · 005 に実施例 7 に記載の本発明方法によるェン ド トキシ ン測定剤 0 . 2 7 ^を加え、 3 7 で 3 0分間加温した。 実施例 8 と同様に ジァゾカ ップリ ング後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、 別に作成した検量線 （第 5図） の b より E . coli 0111 ： B 4 エン ド トキシ ン換算値と して表わした。 第 3表に示すよう に 3 例中全例において高濃度のェン ド トキシンが検出され （健常 人 ： 6 0 pgZ 以下） 、 本発明方法はグラム陰性菌尿路感染症 の迅速確定診断法と して、 きわめて有力な手法であるこ とが理 解できょう。
    [0102] (以下余白）
    [0103] 第 3表
    [0104] グラム陰性菌感染症の尿中ェン ド トキシ ン濃度
    [0105] No. tLl CFU * /mi エ ン ド トキシ ン
    [0106] ( ng/ η£ )
    [0107] 1 Escherichia coli >105 1056.5
    [0108] 2 Serratia marcescens >103 18.0
    [0109] 3 Serratia marcescens >104 216.7
    [0110] * コロニー形成単位
    [0111] 実施例 1 0
    [0112] 脳脊髄液検体の測定
    [0113] 自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、 髄液中にシユー ドモナ ス · エノレギノ ーサ ( Pseudomonas aeruginosa ) およひへモ フ ィ ルス · ィ ン フ ノレェ ンザ (Haemophilus influenzae) を検出 した 細菌性髄膜炎の 3症例につき、 本発明方法によるェン ド トキシ ンの定量を行った。
    [0114] 腰椎穿刺にて無菌的に採取した髄液 0. 0 5？ ^に注射用蒸留水 0. 0 を加え、 さ らに実施例 5 に記載の本発明方法によるェ ン ド トキシ ン測定剤 0. 1 を加え、 3 7 °Cで 3 0分間加温した 実施例 8 と同様にジァゾカ ツ プリ ング後、 5 4 5 nmでその溶液 の吸光度を測定し、 別に作成した検量線 （第 5 図） の b より E.coli 0111 ： B 4 エ ン ド トキシ ン換算値と して表わした。 第 表に示すよう に、 3例中全例において高濃度のェン ド トキシ ンが検出され （健常人 ： 3 pg/ 以下） 、 本発明方法はグラム 陰性菌髄膜炎の早期迅速診断法と してきわめて有力な手法と し て評価され得る ものである こ とが理解できょ う。 第 4表
    [0115] グラム陰性菌感染髄液の髄液中ェン ド トキシン濃度
    [0116] No. W LLI ¾ エ ン ド トキシ ン
    [0117] ( P9/ rd )
    [0118] 1 Pseudomonas aeruginosa 75 . 5
    [0119] 2 Pseudomonas aeruginosa 108 . 5
    [0120] 3 Haemophilus inf luenzae 34 . 6
    [0121] 産業上の利用可能性
    [0122] 以上述べたよう に、 本発明はライセ一トを用いたェン ド トキ シンに特異的な測定剤を提供する ものであり、 血液や尿、 髄液 等の生体試料中に存在するグラム陰性菌由来のェ ン ド トキシ ン を迅速簡便かつ高い精度で測定する こ とが可能であり、 グラム 陰性菌血症ならびにェン ド トキシ ン血症の迅速な診断ならびに 治療効果の判定に役立つもので、 特に臨床検査医学に貢献する と ころ大である。
    [0123] さ らに本発明は、 注射用蒸留水、 医療用具および注射薬を汚 染したェ ン ド トキシ ンを迅速かつ正確に測定することを可能と し、 これらはいずれも本発明の副次的効果と して、 と く に医薬 品製造分野に貢献すると ころ大である。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . カブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセー ト及び （ 1 → 3 ) — /3 — D—グルカ ン感受性因子に対する抗体を含有してなるェン ド トキシ ンの測定剤。
    2. 請求項 1 記載のエ ン ド トキシ ンの測定剤において、 抗体が モノ ク ローナル抗体である測定剤。
    3 . 請求項 1 記載のェン ド トキシ ンの測定剤において、 抗体が ポ リ ク ローナル抗体である測定剤。
    4 . カブ トガニ · ァメ ボサイ ト ' ライセ一 卜、 （ 1 → 3 ) — /3 一 D—グルカ ン感受性因子に対する抗体及び合成基質を含有し てなるェン ド トキシ ンの測定剤。
    5. 請求項 4記載のエン ド トキシ ンの測定剤において、 抗体が モノ ク ローナル抗体である測定剤。
    6. 請求項 4記載のエン ド トキシ ンの測定剤において、 抗体が ポ リ ク ロ ーナル抗体である測定剤。
    7. ( 1 → 3 ) — D—グルカ ン感受性因子に対する抗体を 固定化した担体にカブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセー トを接 触させて得た （ 1 → 3 ) — yS — D—グルカ ン感受性因子を実質 的に含まないライセー トを含有するエン ド トキシ ンの測定剤。
    8. 請求項 1 〜 7記載のいずれか 1 項のェ ン ド トキシ ンの測定 剤において、 該測定剤が凍結乾燥品である ことを特徴とする測 定剤。
    9. 請求項 7記載のエン ド トキシ ンの測定剤において、 固定化 抗体がセルロース、 ァガロース、 ポ リ アク リ ルア ミ ド、 デキス ト ラ ン、 多孔性シ リ カ ビーズに固定化された抗体である測定剤。
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    US08/427,260| US5605806A|1990-08-22|1995-04-24|Reagent for assaying endotoxin|
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